流感是由流感病毒引起, 以发热、体温升高, 伴有咳嗽、流涕、全身酸痛等为主要症状的急性上呼吸道感染传染病。在公共场所、学校、工厂等人群群集中的地方容易引起暴发流行。2007 年5 月下旬至6月上旬深圳市龙岗区某鞋厂发生一起群体性发热的疫情, 患者出现体温≥38℃、伴有咳嗽、流涕、全身酸痛等症状。为了解病因, 采集发热患者鼻咽拭子和血清样本进行病原学检测。采用分子生物学检测和传统分离培养相结合的方法, 确认该疫情为由H3N2亚型

流感病毒引起的上呼吸道感染暴发。

1　材料和方法

1．1          材料

1．1．1　标本的采集和处理: 标本来源于2007年5 月下旬至6 月上旬深圳市龙岗区某鞋厂不明原因群体性发热患者。采集患者的鼻咽拭子27 份, 2 h 内送实验室检测。加入2 000 U /ml 青霉素、2 000 U /ml链霉素和100 U /ml多粘菌素B, 4℃保存备用。不

能在24 h接种细胞与鸡胚的, 储于- 70℃箱。同时采集急性期患者血清标本17 份和恢复期患者血清标本12 份。

1．1．2　核酸提取试剂盒: Roche High Pure Viral RNAKit购于德国Qiagen公司。

1．1．3　A /B 型流感病毒荧光PCR 检测试剂盒: 购于深圳市科润达生物制品有限公司。

1．1．4　细胞及培养基: MDCK传代细胞为深圳市疾病预防控制中心提供; MEM、小牛血清为美国Gib2co /BRL 公司生产。11115 　标准血清: A /panama /2007 /99 (H3N2 ) 由WHO 提供。

1．1．6　甲型流行性感冒病毒胶体金法快速诊断试剂盒: 由杭州创新生物检控技术有限公司提供。

1．2　仪器美国AB I应用生物系统公司生产的7500 RealTime PCR 荧光定量PCR 仪。

1．3　方法

1．3．1　荧光定量RT - PCR 检测

1．3．1．1　核酸提取: 按Qiagen 公司的RNA 抽提试剂盒说明书进行流感病毒基因组RNA 的抽提。

1．3．1．2　荧光定量RT - PCR反应: A型、B 型流感荧光定量RT - PCR 按试剂盒说明书操作如下

:(1) PCR 反应体系: 反应总体积25μl, 内含8μl 模板, 16125μl 反应混合液, 015μl Taq 酶,0125μl反转录酶。

(2) PCR 反应条件: 42℃ 30 min 逆转录, 95℃变性2 min, 以95℃ 5 s, 60℃ 1 min 扩增40 个循环, 在60℃进行荧光检测。荧光选择: 选FAM 和ROX双色荧光检测通道。

(3) 检测用美国AB I 7500 Real Time PCR 扩增仪检测退火阶段的荧光。

(4) 结果判断:阴性对照Ct≤0 或≥3010,阳性对照Ct≤3010,检测样品Ct≤3010,报告样品阳性。

1．3．2　胶体金法: 按试剂盒说明书操作。

1．3．3　细胞培养分离: 采用MDCK细胞分离法: 将已长成单层的MDCK细胞倒去生长液, 用Hank′s液洗3 遍, 每份标本接种2 ～3 管, 每管接种标本011 ml, 35℃吸附1 h 30 min, 再用Hank′s液洗2遍, 加入1 ml不含牛血清的维持液,至35℃孵育。第

2 天开始观察细胞病变(CPU) , 当出现80% 以上CPU 时冻存。采用微量半加敏血球凝集抑制试验(H I) , 鉴定性别及亚型〔1〕。

1．3．4 　鸡胚培养: 按GB15994 - 1995 的标准〔2〕操作。

1．3．5　中和试验和血凝抑制试验: 血清自1∶2 连续倍比稀释至1∶256。同时测定急性期和恢复期血清病毒抗体,以恢复期血清抗体滴度比急性期增长4倍作为阳性。

2　结　果

2．1　荧光定量RT - PCR 检测经A /B 型流感荧光定量RT - PCR 检测, 27 份鼻咽拭子中, 17 份A 型流感病毒阳性, 阳性率为

62196% (17 /27) ; B 型流感病毒均呈阴性结果。27份标本扩增曲线见图1, 检测判定结果及CT 值见表1。

2．2　胶体金法检测

27 份鼻咽拭子标本中进行了A、B 型流感胶体金法的快速检测, 结果阳性12 份, 阳性率44144%(12 /27) ; B 型流感病毒抗原检测阴性反应, 被诊断为A 型流感病毒引起的流行性感冒。

2．3　中和试验和血凝抑制试验

急性期病人血清17 份, 恢复期病人血清12 份,双份血清学试验结果显示, 有8 个患者双份血清, A型流感病毒血凝抑制试验表明恢复期抗体比较急性期抗体有4 倍或以上增长。

2．4　MDCK细胞、鸡胚分离培养与鉴定

荧光定量RT - PCR 阳性标本同时接种MDCK细胞和鸡胚分离培养, 其中2 份鼻咽拭子标本培养液分离出流感病毒, 经A /B 型和A 亚型标准血清进行H I试验, 结果有2 份培养液与H3N2 标准血清产生血凝抑制现象, 与其他各型或亚型的标准血清均未产生抑制现象。结果是分离出2 株H3N2 亚型流感病毒, 阳性率7141% (2 /27) ; 鸡胚分离培养未分离到流感病毒。215　检测结果分析多重荧光定量RT - PCR、病毒分离和血清学检测结果, 见表2。

3　讨　论

2007年5 月下旬至6 月上旬深圳市龙岗区某鞋厂发生不明原因的群体性发热, 该厂有8个分厂1个管理部门共有17 602工人, 其中男4 931人, 发病人数27 人,罹患率5510 /万, 女12 671 人, 发病人数188 人, 罹患率148100 /万。经统计学处理分析(χ2 = 25178, P < 010001) , 男女发病率差异有统计学意义。女性发病率远高于男性发病率, 可能与女性职工所占比例较大71199 % (12 671 /17 602) 有关。该起疫情共215 人发病,罹患率为122115 /万。主要临床症状为发热( ≥38℃) 、咽痛、头痛、咳嗽、乏力、全身四肢酸痛、扁桃腺肿大, 部分伴有鼻塞流涕等症状, 均符合流感样病例的定义。根据临床症状,5 月30日对10名现症病例进行咽拭子采样病, 并在现场进行胶体金法快速检测, 结果5 份A 型流感病毒阳性; 经RT - PCR方法检测7份A型流感病毒阳性。6 月1 日再次采集现症病例咽拭子17份, 现场

胶体金法快速检测7份A型流感病毒阳性; 经RT -PCR方法检测10份A型流感病毒阳性。根据流行病学、血清学及分子生物学的证据证实, 这是一起H3N2 亚型流感病毒引起流感样病例的局部暴发流行。

该起疫情共采样27 份, 标本经多重荧光定量RT - PCR 检测, 阳性率为62196% ( 17 /27) , 胶体金法检测, 阳性率为44144% (12 /27) , 细胞分离培养法检测, 有2 起阳性, 阳性率为7141% ( 2 /27) 。鸡胚分离培养呈阴性。12 份双份血清中, 有8 份恢复期抗体比较急性期抗体有4 倍或以上增长。从检测结果的综合分析, 荧光定量RT - PCR 方法的阳性率明显高于其他方法, 与报道记载的荧光定量RT -PCR 检测结果, 明显高于MDCK细胞培养、鸡胚培养阳性率相一致〔2, 3〕。因为荧光定量RT - PCR 方法非常敏感, 特异性强, 原始标本中即使很少的病毒量也能检测到流感病毒核酸, 能在3～4 h内得出结果,可作为快速的流感病毒检测诊断方法; 胶体金法的检测, 简单、快速易操作可在现场检测,特异性强, 但灵敏度较荧光定量RT - PCR 低; 血清学检测需要采集患者双份血清, 时间比较长, 且不容易采到恢复期的血清, 因为人员流动性较大; 分离培养, 受影响的因素较多, 病毒量过少的标本不一定能用细胞、鸡胚分离到, 且加上细胞毒性和采集的标本有轻微的污染等因素影响了病毒的分离〔4〕。细胞培养的分离率低,可能与标本的病毒含量要求及标本采集、运输、保存要求较高有关〔2〕。这起鼻咽拭子标本鸡胚培养未分离到流感病毒, 可能与甲3 型流感病毒对鸡胚不敏感有关。因此, 采用荧光定量RT - PCR 和传统方法相结合, 同时结合其临床特征及流行病学调查, 可以快速查明引起本次疾病暴发的病因, 为及早控制疫情

提供依据。

参　考　文　献

〔1〕　GB1594 - 19951流行性感冒诊断标准及处理原则1北京: 中国标准出版社, 20031131 - 138

〔2〕　程小雯, 周丽, 赵锦, 等1荧光定量RT - PCR 在流感病毒检测上的应用1中华实验和临床病毒学杂志, 2004, 18: 289 -

2901

〔3〕　张怡明, 罗学辉, 张建群1荧光定量RT - PCR对12起学校群体性发热监测结果分析1 中国卫生检验杂志, 2005, 1352 -

13531

〔4〕　EchavarriaM, FormanM, Ticehurst J, et al1 PCR method forde2tection of adenovirus in urine of healthy and human immunodeficien- cy virus - infected individuals1 J CliniMicrobiology, 1998, 36:3323 - 33261