
深圳市龙岗区群体性发热流感样病例检测结果分析
发布时间:2015/2/10 13:07:50
甘莉萍1, 刘渠1, 陈应坚1, 杨慧1, 程小雯2
[ 摘要] 目的: 对2005 年1 月至12 月深圳市龙岗区流感样疫情进行病原学分析和流行病学调查并进行检测方法比较。方法: 对群体性发热的14 起病例107 份鼻咽拭子和85 份血清标本, 采用荧光定量RT ! PCR 方法; Influenza A/ B IgMELISA; 胶体金法; 鸡胚分离培养方法和血凝抑制试验进行病原学和血清学检测。结果: 14 起107 份标本中荧光定量RT ! PCR 检测10 起45 份阳性, 阳性率为42% ( 45/ 107) ; 10 起85 份血清标本中, A 型流感IgM 7 起17 份阳性。阳生率20% ( 17/ 85) ; 对2 起30 份标本采用胶体金法检测1 起3 份阳性, 阳性率10% ( 3/ 30) 。鸡胚培养12 起77 份标本中, 3起3 份阳性, 阳性率3 9% ( 3/ 77) , 其中, 2 起分离出H1N1 流感病毒株, 1 起分离出流感病毒H3N2 亚型病毒株。暴发时
间分布情况集中在3~ 5 月份, 其中5 月份的4 起疫情中。3 宗分离出流感病毒株。结论: 3~ 5 月份是深圳市龙岗区流感暴发流行的高峰期, 以A 型流感为主, 其次为B 型流感。采用荧光定量RT ! PCR 方法检测流感病毒, 特异性强, 灵敏度高,能在3~ 4 h 内得结果, 可作为快速的流感病毒检测诊断方法, 有效控制疫情。
[ 关键词] 流感病毒; 荧光定量RT ! PCR; 血清IgM
流感是由流感病毒引起以发热, 体温∀38# , 并伴有咳嗽、流涕, 全身酸痛症状为主要症状。对不明原因的集体性发热, 快速准确诊断对控制疫情起着关键的作用。荧光定量RT ! PCR 具有直观、快速; 重复性好特异性强, 敏感性高和易操作等特点[ 1] , 可作为流感病原体的快速诊断。胶体金法的检测, 简单、快速易操作可在现场检测, 但成本较高, 不易推广。接种鸡胚与狗肾传代细胞( MDCK)进行病毒分离定型是最传统方法, 但需要的时间较长, 不利于疫情的及时控制, 荧光定量RT ! PCR 和传统方法相结合, 有利于及时诊断和流行病学调查。现将14 起群体性发热患者进流感病毒监测, 结果报告如下:
1 材料与方法
1. 1 标本的采集和处理 标本来源2005 年1~ 12 月的不明原因群体性发热, 体温∀38# 并伴有咳嗽、流涕、全身酸痛症状的患者, 采集患者的鼻咽拭子冷藏送检; 加入
2000 。/ ml 青霉素2000 。/ ml 链霉素和100。/ ml 多粘菌素B。4 # 保存备用, 不能在24 h 接种鸡胚的储于- 80# 冰箱。
1。2 荧光定量RT ! PCR 检测
1.2.1 核酸提取购于德国Roche High Pure Viral RNAKit公司。
12
13 胶体金法 甲型流行性感冒病毒胶体金法快速诊断试剂盒, 由杭州创新生物检控技术有限公司提供, 按试剂盒说明书操作。
14 血清流感A/ BIgM 抗体检测 InfluenzaA/ B IgMELISA 由德国IBL 公司提供, 按试剂盒操作说明书操作。
15 鸡胚培养 按GB15994! 1995 的标准[ 2] 操作。
16 标准血清 A/ New Caledonia/ 20/ 99 ( H1N1) A/ panama/ 2007/ 99 ( H3N2) B/ Beijing/ 243/ 97 B/ Yamanashi/ 166/98 由WHO 提供。
2 结果
21 荧光定量RT ! PCR 检测验 14 起107 例患者的鼻咽拭子中经A 型流感荧光定量RT ! PCR 检测, 结果有10 起被诊断为由A 型流感病毒引起, 见表1。在10 起阳性事件
中, 有77 份经荧光定量RT ! PCR 检测, 45 份的鼻咽拭子结果表明为A 型流感病毒呈阳性反应, 阳性率5844%( 45/ 77) 。A 型流感荧光RT ! PCR 呈阴性标本进行了B 型流感荧光定量RT ! PCR 检测, 结果呈阴性。
22 胶体金法检测2 起A 型流感荧光RT ! PCR 呈阴性标本进行了A、B 型流感胶体金法的快速检测, 结果其中13份标本中B 型流感病毒抗原检测阳性反应, 被诊断为
B 型流感病毒引起的流行性感冒。
23 血清试验 在14 起的群体性发热患者中, 有10 起85例, 做A 型流感IgM 抗体检测。结果7 起17 份A 型流感IgM 抗体阳性率为20%, B 型流感IgM 抗体检测均呈阴性。
24 鸡胚培养与鉴定 在12 起87 例患者的鼻咽拭子中鸡胚培养结果中, 有3 起被诊断为由A 型流感病毒引起的集体性发热。3 起鸡胚培养阳性的13 份标本中有3 份标本分离出流感病毒, 经AB 型和A 亚型标准血清进行HI 试验, 结果有2 份培养液与H1N1 标准血清产生血凝抑制现象, 1 份培养液与H3N2 亚型标准血清产生抑制现象, 其HI 效价∀1: 80。与其他各型或亚型的标准血清均未产生抑制现象。
25 检测结果分析 对14 起群体性发热事件检测流感病毒中, 其检测结果见表1。经A 型流感荧光定量RT ! PCR法检测有10 起阳性, 血清I gM 检测阳性7 起阳性, 阳性率70% ( 7/ 10) ; 胶体金法检测2 起, 1 起阳性; 鸡胚培养法检测14起, 有3 起阳性, 阳性率2142% ( 3/ 14) 。在A 型流感荧光定量RT ! PCR 法检测4 起阴性标本中, 其中2 起标本做B型流感荧光定量RT ! PCR 法检测呈阴性, 另2 起标本做A、B 型流感胶体金法的快速检测, 其中1 起B 型流感病毒抗原检测阳性, 1 起A、B 型流感病毒抗原检测阴性。14 起发热病例中, 荧光定量RT ! PCR、血清IgM、鸡胚培养均呈阳性有2 起; 荧光定量RT ! PCR 和血清IgM 检测, 均呈阳性有7 起; 胶体金法的快速检测呈阳性有1 起。
3 讨论
2005 年1~ 12 月深圳市龙岗区共发生14 起不明原因的群体性发热, 经采样监测, 结果有10 起是由A 型流感病毒引起的流行性感冒, 1 起是由B 型流感病毒引起的流行性感冒, 另3 起是其他病因引起的。14 起107 份标本中荧光定量RT ! PCR 检出的总阳性率为5844% ( 45/ 107) , 血清IgM 抗体检测总阳性率为20% ( 17/ 85) 。胶体金法检测的总阳性率为10% ( 3/ 30) , 鸡胚培养总分离率39% ( 3/77) , 从检测结果的综合分析, 荧光定量RT ! PCR 方法的阳性率明显高于其他方法, 与报道记载的荧光定量RT !PCR 检测结果明显高于鸡胚培养、MDCK 细胞培养阳性率相一致[ 3] 。荧光定量RT ! PCR 对14 起的阳性率和血清IgM抗体检测的阳性率比较没有明显的差异, 但总的阳性率存在明显差异, 这与患者的发病采样时间有很大关系, 患者发病早期
机体免疫反应过程中, 血清IgM 抗体含量较低, 不易检出, 而荧光RT ! PCR 方法灵敏度高, 对早期的感染者可检测到流感病毒核酸。从14 起发热的患者中, 有3 起3 份分离出流感病毒株的患者, 其荧光定量RT ! PCR 检测阳性, 血清A型流感IgM 阴性。检测结果表明, 采集患者标本的时间, 对提高鸡胚培养的分离率较大关系, 发病2~ 3 d 是最佳的采样时间。鸡胚培养的分离率低, 可能与标本的病毒含量要求及标本采集、运
输、保存要求较高有关[3] 。
根据GB15994! 1995 的标准, 流感病原学的检测方法有传统的鸡胚和MDCK 细胞培养法及快速的间接免疫光法、间接免疫酶联免疫试验等。传统的检测方法准确、可靠、稳定, 但对标本的采集和运送要求较高, 容易造成检测阳性率偏低, 且培养时间长, 费时、繁锁, 无法满足突发事件的应急要求。采用荧光定量RT ! PCR 方法检测流感病毒, 特异性强, 灵敏度高, 能在3~ 4 h 内得结果, 可作为快速的流感病毒检测诊断方法, 有效控制疫情; 胶体金法的检测, 简单、快速易操作可在现场检测, 特异性强, 但灵敏度较荧光定量RT ! PCR 低; 采用荧光定量RT ! PCR和传统方法相结合, 有利于及时诊断和流行病学调查。
从14 起群体性发热的事件中, 经荧光定量RT ! PCR检测有10 起确诊为A 型流感病毒引起的发热, 经胶体金法检测有1 起确诊为B 型流感病毒引起的发热。发病的时间分布, 3~ 5 月份是深圳市龙岗区流感暴发流行的高峰期,病人集中在夏季和冬季, 主要以A 型流感为主, 其次是B型流感, A 型流感H1N1 和H3N2 流感病毒株是引起深圳市龙岗区流感疫情的病毒株, 由A 型流感病毒引起的流行性感冒是14 起群体性发热事件的主要病因。多种检测方法比
较, 荧光定量RT ! PCR 检测具有特异性强, 灵敏度高, 能在3~ 4 h 内得结果, 可作为快速的流感病毒检测诊断方法,有效控制疫情。
[ 参考文献]
[ 1] 严菊英, 卢亦愚, 冯燕, 等. TaqMan 荧光定量RT - PCR 快速
检测甲3 型流感病毒[ J ] . 中国人兽共患病杂志, 2005, 21( 2) : 169- 172.
[ 2] GB1594- 1995. 流行性感冒诊断标准及处理原则[S ] .
[ 3] 程小雯, 周丽, 赵锦, 等. 荧光定量RT - PCR 在流感病毒检测上的应用[ J ] . 中华实验和临床病毒学杂志, 2004, 18( 3) : 289- 29