流感是由流感病毒引起以发热, 体温∀38# , 并伴有咳嗽、流涕, 全身酸痛症状为主要症状。对不明原因的集体性发热, 快速准确诊断对控制疫情起着关键的作用。荧光定量RT ! PCR 具有直观、快速; 重复性好特异性强, 敏感性高和易操作等特点[ 1] , 可作为流感病原体的快速诊断。胶体金法的检测, 简单、快速易操作可在现场检测, 但成本较高, 不易推广。接种鸡胚与狗肾传代细胞( MDCK)进行病毒分离定型是最传统方法, 但需要的时间较长, 不利于疫情的及时控制, 荧光定量RT ! PCR 和传统方法相结合, 有利于及时诊断和流行病学调查。现将14 起群体性发热患者进流感病毒监测, 结果报告如下:

1 材料与方法

1． 1 标本的采集和处理 标本来源2005 年1~ 12 月的不明原因群体性发热, 体温∀38# 并伴有咳嗽、流涕、全身酸痛症状的患者, 采集患者的鼻咽拭子冷藏送检; 加入

2000 。/ ml 青霉素2000 。/ ml 链霉素和100。/ ml 多粘菌素B。4 # 保存备用, 不能在24 h 接种鸡胚的储于- 80# 冰箱。

1。2 荧光定量RT ! PCR 检测

1．2．1 核酸提取购于德国Roche High Pure Viral RNAKit公司。

1􀀁2􀀁2 A 型B 型流感荧光RT ! PCR按试剂盒说明书操作。

1􀀁3 胶体金法 甲型流行性感冒病毒胶体金法快速诊断试剂盒, 由杭州创新生物检控技术有限公司提供, 按试剂盒说明书操作。

1􀀁4 血清流感A/ BIgM 抗体检测 InfluenzaA/ B IgMELISA 由德国IBL 公司提供, 按试剂盒操作说明书操作。

1􀀁5 鸡胚培养 按GB15994! 1995 的标准[ 2] 操作。

1􀀁6 标准血清 A/ New Caledonia/ 20/ 99 ( H1N1) A/ pana􀀂ma/ 2007/ 99 ( H3N2) B/ Beijing/ 243/ 97 B/ Yamanashi/ 166/98 由WHO 提供。

2 结果

2􀀁1 荧光定量RT ! PCR 检测验 14 起107 例患者的鼻咽拭子中经A 型流感荧光定量RT ! PCR 检测, 结果有10 起被诊断为由A 型流感病毒引起, 见表1。在10 起阳性事件

中, 有77 份经荧光定量RT ! PCR 检测, 45 份的鼻咽拭子结果表明为A 型流感病毒呈阳性反应, 阳性率58􀀁44%( 45/ 77) 。A 型流感荧光RT ! PCR 呈阴性标本进行了B 型流感荧光定量RT ! PCR 检测, 结果呈阴性。

2􀀁2 胶体金法检测2 起A 型流感荧光RT ! PCR 呈阴性标本进行了A、B 型流感胶体金法的快速检测, 结果其中13份标本中B 型流感病毒抗原检测阳性反应, 被诊断为

B 型流感病毒引起的流行性感冒。

2􀀁3 血清试验 在14 起的群体性发热患者中, 有10 起85例, 做A 型流感IgM 抗体检测。结果7 起17 份A 型流感IgM 抗体阳性率为20%, B 型流感IgM 抗体检测均呈阴性。

2􀀁4 鸡胚培养与鉴定 在12 起87 例患者的鼻咽拭子中鸡胚培养结果中, 有3 起被诊断为由A 型流感病毒引起的集体性发热。3 起鸡胚培养阳性的13 份标本中有3 份标本分离出流感病毒, 经AB 型和A 亚型标准血清进行HI 试验, 结果有2 份培养液与H1N1 标准血清产生血凝抑制现象, 1 份培养液与H3N2 亚型标准血清产生抑制现象, 其HI 效价∀1: 80。与其他各型或亚型的标准血清均未产生抑制现象。

2􀀁5 检测结果分析 对14 起群体性发热事件检测流感病毒中, 其检测结果见表1。经A 型流感荧光定量RT ! PCR法检测有10 起阳性, 血清I gM 检测阳性7 起阳性, 阳性率70% ( 7/ 10) ; 胶体金法检测2 起, 1 起阳性; 鸡胚培养法检测14起, 有3 起阳性, 阳性率21􀀁42% ( 3/ 14) 。在A 型流感荧光定量RT ! PCR 法检测4 起阴性标本中, 其中2 起标本做B型流感荧光定量RT ! PCR 法检测呈阴性, 另2 起标本做A、B 型流感胶体金法的快速检测, 其中1 起B 型流感病毒抗原检测阳性, 1 起A、B 型流感病毒抗原检测阴性。14 起发热病例中, 荧光定量RT ! PCR、血清IgM、鸡胚培养均呈阳性有2 起; 荧光定量RT ! PCR 和血清IgM 检测, 均呈阳性有7 起; 胶体金法的快速检测呈阳性有1 起。

3 讨论

2005 年1~ 12 月深圳市龙岗区共发生14 起不明原因的群体性发热, 经采样监测, 结果有10 起是由A 型流感病毒引起的流行性感冒, 1 起是由B 型流感病毒引起的流行性感冒, 另3 起是其他病因引起的。14 起107 份标本中荧光定量RT ! PCR 检出的总阳性率为58􀀁44% ( 45/ 107) , 血清IgM 抗体检测总阳性率为20% ( 17/ 85) 。胶体金法检测的总阳性率为10% ( 3/ 30) , 鸡胚培养总分离率3􀀁9% ( 3/77) , 从检测结果的综合分析, 荧光定量RT ! PCR 方法的阳性率明显高于其他方法, 与报道记载的荧光定量RT !PCR 检测结果明显高于鸡胚培养、MDCK 细胞培养阳性率相一致[ 3] 。荧光定量RT ! PCR 对14 起的阳性率和血清IgM抗体检测的阳性率比较没有明显的差异, 但总的阳性率存在明显差异, 这与患者的发病采样时间有很大关系, 患者发病早期

机体免疫反应过程中, 血清IgM 抗体含量较低, 不易检出, 而荧光RT ! PCR 方法灵敏度高, 对早期的感染者可检测到流感病毒核酸。从14 起发热的患者中, 有3 起3 份分离出流感病毒株的患者, 其荧光定量RT ! PCR 检测阳性, 血清A型流感IgM 阴性。检测结果表明, 采集患者标本的时间, 对提高鸡胚培养的分离率较大关系, 发病2~ 3 d 是最佳的采样时间。鸡胚培养的分离率低, 可能与标本的病毒含量要求及标本采集、运

输、保存要求较高有关[3] 。

根据GB15994! 1995 的标准, 流感病原学的检测方法有传统的鸡胚和MDCK 细胞培养法及快速的间接免疫光法、间接免疫酶联免疫试验等。传统的检测方法准确、可靠、稳定, 但对标本的采集和运送要求较高, 容易造成检测阳性率偏低, 且培养时间长, 费时、繁锁, 无法满足突发事件的应急要求。采用荧光定量RT ! PCR 方法检测流感病毒, 特异性强, 灵敏度高, 能在3~ 4 h 内得结果, 可作为快速的流感病毒检测诊断方法, 有效控制疫情; 胶体金法的检测, 简单、快速易操作可在现场检测, 特异性强, 但灵敏度较荧光定量RT ! PCR 低; 采用荧光定量RT ! PCR和传统方法相结合, 有利于及时诊断和流行病学调查。

从14 起群体性发热的事件中, 经荧光定量RT ! PCR检测有10 起确诊为A 型流感病毒引起的发热, 经胶体金法检测有1 起确诊为B 型流感病毒引起的发热。发病的时间分布, 3~ 5 月份是深圳市龙岗区流感暴发流行的高峰期,病人集中在夏季和冬季, 主要以A 型流感为主, 其次是B型流感, A 型流感H1N1 和H3N2 流感病毒株是引起深圳市龙岗区流感疫情的病毒株, 由A 型流感病毒引起的流行性感冒是14 起群体性发热事件的主要病因。多种检测方法比

较, 荧光定量RT ! PCR 检测具有特异性强, 灵敏度高, 能在3~ 4 h 内得结果, 可作为快速的流感病毒检测诊断方法,有效控制疫情。

[ 参考文献]

[ 1] 严菊英, 卢亦愚, 冯燕, 等. TaqMan 荧光定量RT - PCR 快速

检测甲3 型流感病毒[ J ] . 中国人兽共患病杂志, 2005, 21( 2) : 169- 172.

[ 2] GB1594- 1995. 流行性感冒诊断标准及处理原则[S ] .